Calculadora de temperatura de fusión (Tm) de cebadores
Introduce uno o dos cebadores de PCR para obtener su temperatura de fusión por tres métodos, el contenido de GC, la longitud, el peso molecular y comprobaciones rápidas de diseño, además de una temperatura de alineamiento sugerida para el par.
Última actualización:
Opcional: producto de PCR (para la temperatura de alineamiento óptima de Rychlik)
Cómo usar Calculadora de temperatura de fusión (Tm) de cebadores
- Pega tu cebador directo 5'→3'. Se ignoran los espacios, los números y las etiquetas 5'/3', y la U se lee como T.
- Añade el cebador reverso (opcional) para comparar el par y comprobar dímeros de cebadores.
- Fija las condiciones de reacción o elige un ajuste predefinido. Usa los valores de K⁺/Na⁺ y Mg²⁺ del tampón de tu polimerasa y la concentración final de cebador.
- Lee los resultados: la Tm por vecinos más cercanos es la más precisa; los valores ajustados por sal y básicos se dan para comparar con protocolos antiguos.
- Empieza la PCR a la Ta sugerida y ajústala con un gradiente. Copia los resultados para tu cuaderno de laboratorio.
Las tres fórmulas de Tm
| Método | Fórmula | Ideal para |
|---|---|---|
| Regla de Wallace | Tm = 2 °C × (A + T) + 4 °C × (G + C) | Estimación rápida para oligos cortos (menos de 14 nt) |
| Marmur–Doty (básica) | Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) / N | Estimación aproximada para 14+ nt con unos 50 mM de Na⁺ |
| Ajustada por sal | Tm = 81.5 + 16.6 × log₁₀[Na⁺] + 0.41 × %GC − 600 / N | Comparar cebadores con distintos niveles de sal monovalente |
| Vecinos más cercanos | Tm = ΔH° / (ΔS° + R × ln(CT/4)) − 273.15 | La más precisa; el valor recomendado |
N es la longitud del cebador, [Na⁺] está en mol/L y CT es la concentración de cebador. En el método de vecinos más cercanos, ΔH° y ΔS° son las sumas de los parámetros unificados de SantaLucia (1998) para cada paso de dinucleótido más los términos de iniciación terminal. La entropía se corrige por sal con ΔS° + 0.368 × (N − 1) × ln[Na⁺eq], donde el Mg²⁺ se convierte en un equivalente de sodio de 120 × √([Mg²⁺] − [dNTP]) mM. Para cebadores autocomplementarios se usa CT en lugar de CT/4. El peso molecular usa la fórmula anhidra (A × 313.21 + T × 304.2 + C × 289.18 + G × 329.21 − 61.96) para un oligo sin modificar con un hidroxilo en 5'.
Lista de comprobación para diseñar cebadores
| Propiedad | Objetivo típico | Por qué importa |
|---|---|---|
| Longitud | 18–25 nt | Lo bastante largo para ser específico y lo bastante corto para alinear con eficiencia |
| Contenido de GC | 40–60% | Estabilidad equilibrada; los cebadores muy ricos en GC se unen de forma inespecífica |
| Tm | 55–65 °C | Permite usar una temperatura de alineamiento estricta |
| Diferencia de Tm en un par | ≤ 2–3 °C | Ambos cebadores alinean bien a la misma temperatura |
| Pinza GC en 3' | 1–2 G/C en las últimas 5 bases, idealmente terminando en G o C | Estabiliza el extremo 3' donde empieza la polimerasa |
| Series y repeticiones | Sin series de 4+ bases idénticas ni 4+ repeticiones de dinucleótidos | Reduce el deslizamiento y el cebado erróneo |
| Autocomplementariedad y complementariedad cruzada | Sin tramo complementario de 4+ bases en el extremo 3' | Evita horquillas y dímeros de cebadores |
Las comprobaciones de horquillas y dímeros de aquí solo buscan tramos complementarios contiguos. Son un cribado rápido, no una predicción completa de la estructura secundaria. Para diseñar un cebador reverso a partir de la cadena inferior de tu diana, usa la herramienta de complemento inverso de ADN.
Preguntas frecuentes
¿Qué es la temperatura de fusión (Tm) de un cebador?
La Tm es la temperatura a la que la mitad de las moléculas del cebador están unidas a su ADN complementario y la otra mitad están libres. Depende de la secuencia, la longitud, la concentración de sal y la concentración de cebador. Las temperaturas de alineamiento de la PCR se fijan en relación con la Tm.
¿Qué método de Tm debo usar?
Usa el valor de vecinos más cercanos. Suma la estabilidad medida de cada par de bases vecinas (SantaLucia 1998) y corrige por sal y concentración de cebador, por lo que suele quedar a pocos grados de los valores medidos. Las fórmulas básicas solo cuentan las bases G y C y pueden desviarse entre 5 y 10 °C.
¿Cómo elijo la temperatura de alineamiento?
Un punto de partida habitual es unos 5 °C por debajo de la Tm más baja de los dos cebadores, y luego ajustarla con un gradiente de temperatura. Algunas polimerasas de alta fidelidad recomiendan alinear a la Tm o por encima, así que consulta siempre las instrucciones de tu enzima.
¿Por qué mi proveedor muestra una Tm distinta?
Las calculadoras usan distintos conjuntos de parámetros, correcciones de sal y concentraciones por defecto. Una Tm calculada con 50 mM de Na⁺ y 50 nM de oligo será varios grados menor que una con 1 M de Na⁺ o con Mg²⁺. Introduce las mismas condiciones para comparar en igualdad.
¿Cómo afecta el Mg²⁺ a la Tm?
El magnesio divalente estabiliza los dúplex de ADN mucho más que el sodio, así que un 1.5–2 mM típico de Mg²⁺ sube la Tm de forma notable. Los dNTP se unen al Mg²⁺, por lo que la cantidad libre es aproximadamente Mg²⁺ menos dNTP. La herramienta convierte el Mg²⁺ libre en un equivalente de sodio (120 × √[Mg²⁺ − dNTP], von Ahsen et al. 2001).
¿Qué hace que un cebador de PCR sea bueno?
Las pautas típicas son 18–25 bases, 40–60% de GC, una Tm de unos 55–65 °C con ambos cebadores a 2–3 °C entre sí, una o dos bases G o C en el extremo 3' y ninguna serie larga, repetición ni tramo autocomplementario.
¿Puedo usar bases degeneradas como N o R?
No directamente. La Tm depende de la base real, así que sustituye cada posición degenerada por una base concreta. Calcular con las opciones más ricas en GC y más ricas en AT te da el rango de valores de Tm posibles.
¿Se prueban todas las herramientas de FreeToolCabin para comprobar su calidad y precisión?
Sí. Cada herramienta del sitio pasa pruebas automáticas en navegadores reales para comprobar que el resultado es correcto y que no hay errores. Si encuentras un fallo o tienes una sugerencia, escríbenos a [email protected] y lo revisaremos.